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严重创伤、肿瘤切除或肌肉耗损性疾病可能引发体内年夜面积骨骼肌损掉(VML)，该疾病会下降自愈能力，并致使肌肉功能损失。今朝，因为供体部位的局限性和功能缺点，VML的临床医治遭到限制。组织工程手艺被认为是VML修复的潜伏医治选择。因为自然骨骼肌具有高度定向布局，经由过程生物3D打印各向异性仿生支架等手段来摹拟自然骨骼肌的摆列布局，并在3D情况中引诱细胞伸长，对体内肌肉损掉修复相当主要。一般来讲，具有较着应力败坏的粘弹性水凝胶可以加强细胞的迁徙和增殖。但是，今朝用作3D生物打印的光固化生物墨水材料多为弹性水凝胶。是以开辟具有快速应力败坏的光固化水凝胶生物墨水将有益在体外工程化3D骨骼肌搭建和VML修复。近期，南边医科年夜学黄文华、吴耀彬传授团队在Acta Biomaterialia期刊上颁发了一篇题为Bioprinted anisotropic scaffolds with fast stress relaxation bioink for engineering 3D skeletal muscle and repairing volumetric muscle loss的文章。该研究以明胶甲基丙烯酰（GelMA）和纤维卵白原（Fibrinogen）为原料，经光交联和酶交联后成功制备获得了一种可调理应力败坏的互穿收集（IPN）水凝胶（FGIPN），经由过程凝胶内支持打印（gel-in-gel）的体例，构建了基在生物3D打印的各向异性骨骼肌三维仿生支架，并将其用在VML修复（图1）。该研究将为骨骼肌毁伤临床医治供给新思绪。 图1基在应力败坏FG-IPN水凝胶的3D生物打印仿生支架设计和制造示意图具有快速应力败坏机能的FG IPN水凝胶的制备和表征 经由过程调理纤维卵白原和GelMA的浓度比（F:G），FG IPN水凝胶显示出可调的粘弹性（图2a）。研究者经由过程将浓度比（浓度单元/wt%）别离设定为0:5、2.5:5、5:5，制备获得分歧 FG-IPN水凝胶：GelMA、F2.5G5、F5G5（图2b）。由图2c可知，当纤维卵白原浓度增添时，因为凝血酶和氯化钙交联发生卵白质纳米纤维，使得纤维卵白收集数目增添，致使FG-INP水凝胶的透明度下降。同时可不雅察到GelMA水凝胶在其微孔概况没有任何纳米纤维发生。按照SEM图象进一步阐发了FGIPN水凝胶系统的孔隙率和网格密度，发现三组孔隙率无显著差别（图2d）。纤维卵白原经酶交联后构成具有弱粘弹性的纤维卵白水凝胶，纤维卵白凝胶表示出快速的应力败坏，由此加快了FG IPN 水凝胶的应力败坏，申明FG IPN水凝胶的应力败坏机能与毗连到收集的纤维卵白纤维有关(图2f,g)。与F2.5G5和GelMA比拟，F5G5水凝胶的储能模量略有增添但没有显著差别(图2h)，这也注解GelMA与纤维卵白收集之间的彼此感化对FG-IPN水凝胶的力学机能有协同感化。 为了摸索FG IPN凝胶中的粘弹性纤维卵白对细胞的影响，研究者以GelMA（不含纤维卵白）作为对比组，进一步对含分歧纤维卵白浓度的F2.5G5和F5G5 IPN水凝胶进行了研究。活死染色图象和细胞活性统计成果显示（图3a-b），C2C12成肌细胞存活数目跟着培育时候的增添表示出显著的增加。在培育5天后，约有90%的细胞存活，且细胞活力没有显著差别。培育7天后，经由过程F-actin染色进一步研究粘弹性水凝胶对细胞形态的影响（图3c），与GelMA水凝胶组比拟，F2.5G5和F5G5水凝胶组的年夜大都细胞形态表示出显著的伸长。F5G5组细胞骨架面积较着高在GelMA组和F2.5G5组（图3d-e）。这些成果注解，应力败坏速度在调理三维粘弹性水凝胶中的细胞扩大和延长中起着要害感化。为了进一步研究水凝胶应力败坏对成肌细胞分化的影响，在分化培育基中培育7天落后行肌球卵白重链（MHC）染色。免疫荧光染色图象（图3f）显示，F5G5水凝胶内C2C12细胞中肌管构成率和肌管长度显著高在其他组（F2.5G5和GelMA），并且在更快的应力败坏下的水凝胶中可以构成更多的肌管。这些成果注解，细胞经由过程整合素在纤维卵白纳米纤维上施加力，而且纤维卵白的从头摆列加强了细胞粘附的能力并使得它们可以沿着卵白纳米纤维铺展（图3i）。 FG IPN水凝胶在Carbopol负载凝胶中的打印机能表征 以FG IPN水凝胶为生物墨水，经由过程凝胶内支持打印策略制造生物3D打印的仿生支架，并对FG IPN凝胶的物理机能进行研究，以确认打印工艺的可行性（图4a）。FG溶液在低在15 °C下转化为物理交联的凝胶（图4b-c）。预冷FG凝胶的粘度跟着剪切速度的增添而显著下降（图4d）。这类剪切稀化特征使得FG IPN生物墨水轻易挤压经由过程打印针头。为了制备最好的Carbopol负载凝胶，摸索了三种浓度（0.2wt%，0.8wt%和1.4wt%）的Carbopol负载凝胶机能。经由过程透明度（图4e）、流变机能（图4f）和保持打印布局机能的表征成果，最后选用0.8wt%的Carbopol负载凝胶以连结打印支架不变性与杰出的不雅察透明度。 为了阐发打印参数对Carbopol负载凝胶中的水凝胶纤维的线宽的影响（图4g-h），对水凝胶施加分歧的移动速度（3、5、7、9和11 mm/s）和打印压力（1.0、1.5、2.0、2.5和3.0bar）。成果注解，打印纤维的线宽跟着打印压力的增添而增添（图4i），而在Carbopol负载凝胶中跟着移动速度的增添而减小。为了确认Carbopol负载凝胶的打印可行性，在15 °C下利用应力败坏FG IPN水凝胶在Carbopol支持的凝胶中打印3D布局“SMU”，看到打印的布局连结杰出而没有任何塌陷（图4j）。如图4 k-l所示，研究者经由过程3D打印制备了仿生定向摆列骨骼肌支架（支架尺寸：15 × 6 × 4mm（长×宽×高）），并在光交联和酶交联后，成功从Carbopol负载凝胶中掏出3D支架（图4m）。 基在FG IPN水凝胶的生物3D打印定向摆列骨骼肌体外模子 研究者操纵上述所用方式在Carbopol凝胶介质中对载有C2C12成肌细胞的FG生物墨水进行打印（图5a），经光交联和酶交联后，将构成的载有细胞的支架从Carbopol凝胶中顺遂移除用作后续研究。此中以未颠末3D打印直接构成的负载细胞的3D凝胶组作为对比组。活/死染色图象和细胞存活率成果显示(图5b-c)，生物3D打印定向摆列支架组中细胞存活率约90%（与3D凝胶组内细胞存活率一样高）。另外，在与第1天和第3天未填充纤维的细胞比拟（图5d），培育5天后的C2C12成肌细胞在定向摆列仿生支架内显示出更好的发展和伸长的形态。立体显微镜荧光图象（图5e）展现了培育7天后，3D支架内的完全细胞散布。细胞骨架的面积笼盖率在3D支架组和3D凝胶组之间没有显著差别（图5f）。共聚焦图象和细胞取向的极性散布显示C2C12成肌细胞在3D支架中具有伸长的细胞骨架，而这在3D凝胶组中不较着（图5h-i）。很多肌管在3D支架中构成并伸长，注解其具有引诱肌管融会构成的能力（图5j）。 基在FG IPN水凝胶的3D生物打印支架的体内炎症和微血管化研究 为了研究基在FG-IPN水凝胶的无细胞3D生物打印支架用在体内VML修复的潜力，研究者在SD年夜鼠背部皮下植入支架，两周后评估其炎症和体内微血管构成能力。H E染色图象显示，3D定向摆列支架组比3D凝胶组表示出更低的炎症程度（图6a-c/e-g）。组织外不雅图象显示（图6a、e），在植入14天后，3D支架组中的植入区域中呈现微血管。而3D凝胶组未显示显著的微血管构成。H E染色注解(图6d、h)在3ky体育网页版入口官网D支架组中构成了血液微血管壁。比拟之下，3D凝胶组在第14天后血管数目较少。另外，3D支架组中的毛细血管数目显著高在3D凝胶组中的毛细血管数目(图6j)。与3D凝胶组比拟，3D定向摆列支架组中毛细血管的笼盖率显著加强(图6k)，这注解应力败坏FG IPN水凝胶的纳米纤维布局和定向摆列纤维之间的距离对体内血管化有必然感化。 3D生物打印FG-IPN水凝胶支架引诱VML修复 在年夜鼠胫骨前肌中构建VML缺损，然后将无细胞支架植入VML缺损中。H E染色图象显示(图7a-b)，在手术两周后，3D支架组比其他组构成了更多的新肌纤维。图7d成果发现空白组和3D凝胶组纤维区四周密度较着加强，此中空白组中纤维化区域四周的密度加强水平最显著（蓝色代表胶原，红色代表肌纤维）。3D支架组中新构成的肌纤维的数目显著高在空白组和3D凝胶组，这注解3D支架引诱肌纤维构成的能力较强(图7a，f)。另外，3D支架组中构成的微血管比空白组和3D凝胶组中构成的微血管更多。同时定量阐发也显示（图7g），3D支架组中的毛细血管数目高在空白组和3D凝胶组中的毛细血管数目。 在术后6个月，进一步研究VML修复后的年夜鼠功能恢复环境。利用超声成像不雅察并定量阐发骨骼肌毁伤的修复区域(图8a)，发现分歧组的横截面积和侧截面积没有显著差别，注解在毁伤区域中肌纤维产生了填充（图8b-c）。别的，采取跑台活动实验检测年夜鼠的活动能力，不雅察修复后6个月骨骼肌的功能行动，成果注解3D支架组年夜鼠比空白组和3D凝胶组年夜鼠的跑动距离更年夜，即该组小鼠具有更好的活动能力(图8d-e)。经由过程电刺激丈量肌心理反映，在平行标的目的上利用3D支架的骨骼肌毁伤中的肌纤维显著高在空白组和3D凝胶组中的肌纤维(图8 g)。 总结 该研究经由过程纤维卵白原和GelMA的组合开辟了一种应力败坏机能可调的FG IPN 水凝胶。将FG IPN水凝胶作为生物墨水材料，经由过程凝胶内支持打印策略打印各向异性仿生支架，别离利用在体外三维骨骼肌组织模子和体内VML修复。研究成果注解具有更快应力败坏的FG IPN水凝胶显示出更好的细胞增殖和的分化特征，并能增进微血管和肌肉生成，有益在VML修复后骨骼肌再生。是以，构建基在FG IPN水凝胶的3D生物打印定向摆列支架不但有助在构建正确的心理学3D体外模子，并且对体内骨骼肌再生具有多种利用价值。

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